# 免疫荧光定量图

## 适用场景

免疫荧光（IF）、共聚焦显微镜、定量荧光显微图像分析。常见于蛋白定位、共定位分析、细胞计数、荧光强度定量。是细胞生物学和分子病理学的核心可视化手段。

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## 核心阅读维度

### 1. 共定位系数（Colocalization Coefficients）

| 系数名称                  | 公式/含义                                  | 取值范围 | 适用场景                              |
| ------------------------- | ------------------------------------------ | -------- | ------------------------------------- |
| **Pearson 相关系数 (rP)** | 协方差标准化，衡量线性相关                  | -1 到 +1 | 两通道信号密度相近时最可靠             |
| **Manders M1 / M2**       | 通道1/通道2 中共定位像素占总像素的比例      | 0 到 1   | 两通道信号强度差异大时使用             |
| **Manders Overlap (R)**   | 实际重叠与最大可能重叠之比                  | 0 到 1   | 通用共定位指标                        |
| **Li's ICQ**              | 基于像素强度相关性的离散度量化              | -0.5 到 +0.5 | 介于 Pearson 和 Manders 之间         |

**关键解释**：
- M1 = 通道1 中与通道2 共定位的信号 / 通道1 总信号
- M2 = 通道2 中与通道1 共定位的信号 / 通道2 总信号
- M1 ≠ M2 时，说明两蛋白的表达量不同但空间重叠

### 2. 图像采集质量控制

- **Sequential scanning**：双通道或多通道必须用顺序扫描（而非同时激发），以消除串扰（cross-talk）
- **光路校准**：两种荧光通道的发射光谱是否有重叠？是否有 spectral bleed-through？
- **ROI 选择**：使用 Lasso 工具选择包含荧光信号的区域，排除无荧光背景
- **阈值设定**：是否使用了自动或手动的强度阈值排除背景噪声？

### 3. 荧光强度定量

- **平均荧光强度**（Mean Intensity）：总荧光强度 / 细胞数或面积
- **阳性率**（% Positive）：荧光强度超过阈值的细胞占总细胞数的比例
- **比值法**：如 p-FOXO3a / Total FOXO3a，需要双通道染色
- **细胞计数**：DAPI 计数总细胞，特定标记阳性细胞 = 阳性率

### 4. 伪彩色与展示规范

- 伪彩色（Fire、LUT）是否正确标注了颜色条？
- 不同通道的对比度/亮度调整是否分别进行？（不能对单通道单独调亮）
- 图像是否经过去噪、反卷积等处理？处理参数是否报告？

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## 常见陷阱

| 陷阱                 | 说明                                           | 如何识别                           |
| -------------------- | ---------------------------------------------- | ---------------------------------- |
| **串扰未消除**       | 两通道同时激发导致光谱重叠，虚假共定位          | 检查是否 sequential scan            |
| **阈值主观设定**     | 不同图像用不同阈值，导致假阳性/阴性             | 阈值是否在所有图像中一致？是否有自动算法？ |
| **内参不稳定**       | 用 GAPDH 或 Actin 做荧光定量内参                | 荧光定量通常不用内参，应报告总蛋白或细胞数 |
| **ROI 选区偏倚**     | 只选荧光强的区域，排除弱信号                    | 检查是否全视野分析还是选择性分析     |
| **过度处理图像**     | 去噪/反卷积过度导致信号失真                     | 要求原始未处理图像（raw data）       |
| **噪声被当信号**     | 弱阳性但未设阈值，背景噪声被计入荧光强度        | 检查信噪比和阈值设定                 |

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## 关键问题模板

1. "共定位分析用的是 Pearson 相关系数还是 Manders 系数？两个系数的物理含义分别是什么？"
2. "图像采集是否用了 sequential scanning 以消除通道间串扰？"
3. "荧光强度定量是用了哪种指标（平均强度、峰值强度、阳性率）？如何排除背景噪声？"
4. "是否有光谱重叠（bleed-through）问题导致假性共定位？是否做了单通道对照确认？"

## 一句话总结

> 免疫荧光的核心是**"溯光源、看共定位、防串扰、查阈值"**——荧光图像的美观不等于定量可靠，串扰和阈值是最容易被忽视的两大杀手。
