# Western Blot 条带图

## 适用场景

Western Blot（免疫印迹）条带的半定量分析，包括磷酸化蛋白检测、总蛋白表达、翻译后修饰（PTM）分析。是生物医学研究中蛋白层面最常用的验证方法。

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## 核心阅读维度

### 1. 内参（Loading Control）选择与验证

| 内参类型         | 常用蛋白举例               | 适用场景                          | 风险                              |
| ---------------- | ------------------------- | --------------------------------- | --------------------------------- |
| 管家蛋白         | GAPDH、β-Actin、β-Tubulin | 普通全细胞裂解液                  | 可能受实验条件调控，不稳定        |
| 总蛋白染色       | Ponceau S、Coomassie      | 磷酸化蛋白等 PTM 研究              | 更可靠但定量精度稍低              |
| 上样量控制       | BCA/Braford 定量后等量上样 | 所有WB                           | 只能控制总蛋白量，不能控制转膜效率 |

**关键检查点**：
- 管家蛋白是否在所有实验条件下表达稳定？（处理组 vs 对照组）
- 是否验证了内参在线性范围内？（做了稀释曲线）
- 磷酸化蛋白是否用了总蛋白或胞浆/胞核分馏的内参，而非全细胞管家蛋白？

### 2. 条带完整性检查

- **裁剪规范**：同一膜上是否清晰标注了裁剪分界线？（磷酸化条带和总蛋白条带来自同一膜的不同抗体剥离/重孵育是常规做法，但必须标注）
- **非相邻泳道拼接**：同一膜上不相邻泳道被拼接到一起时，是否有明确分界线/空格标注
- **曝光均匀性**：整张膜的背景是否均匀？边缘泳道是否与中间泳道曝光一致？

### 3. 定量归一化方式

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归一化值 = (目标条带强度 - 背景) / (内参条带强度 - 背景)
```

- **必须确认**：归一化是 Target / Loading Control，还是先归一化到对照组再计算 fold change？
- **内参一致性**：内参条带强度在所有泳道中是否相近（CV<15%）？如果差异过大，内参本身不可靠

### 4. 线性范围与饱和检测

- **饱和信号**：条带纯白（像素值=255）= 饱和，数据不可用
- **线性范围**：信号强度应与上样量成比例；过饱和导致定量偏低
- **检测方法**：是否做了浓度梯度（dilution series）验证线性范围？
- **多张膜比较**：如果目标条带和内参来自不同膜，是否有交叉参照（bridging）？

### 5. 背景扣除与 ROI 设置

- **背景region**：使用膜上无蛋白区域的平均强度，而非纯白背景
- **ROI一致性**：所有条带使用相同大小的矩形/自由形状选区
- **局部背景**：每个条带附近扣除各自的局部背景，而非全膜平均背景

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## 常见陷阱

| 陷阱                   | 说明                                         | 如何识别                               |
| ---------------------- | -------------------------------------------- | -------------------------------------- |
| **内参不稳定**         | 管家蛋白在不同处理组间表达差异显著           | 检查内参条带灰度是否在所有泳道中相近   |
| **饱和条带定量**       | 曝光过曝导致条带变白，灰度值被截断           | 检查条带是否纯白、是否有光晕           |
| **膜面不均导致假差异** | 转膜时泳道边缘效应造成中间vs边缘信号差异     | 检查同一膜不同区域的信号是否一致       |
| **条带裁剪误导**       | 同一膜不同区域拼接到一起，假装是不同条件     | 寻找膜上泳道间距/背景的不自然断裂       |
| **过曝掩盖阴性**       | 某处理组信号强到过曝，无法与真正阴性区分     | 检查所有条带是否都在线性范围内         |
| **多重比较未校正**     | 3个以上处理组的WB，用独立t检验而不用ANOVA   | 检查统计方法部分                       |

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## 关键问题模板

1. "内参（管家蛋白）的表达是否真的稳定？有没有独立验证其在实验条件下的稳定性？"
2. "所有条带是否都在相机/底物的线性动态范围内？有没有饱和条带被纳入定量？"
3. "归一化方法是 Target/内参 还是其他？不同膜之间如何校正？"
4. "条带是否来自同一张膜的同一次转印？是否有拼接？是否有非相邻泳道的裁剪？"

## 一句话总结

> WB 条带的核心是**"查内参、防饱和、验线性、看裁剪"**——条带灰度只是数字，背后的内参稳定性、线性范围和膜面均匀性才是定量可信度的根基。
