# GSEA 富集图

## 适用场景

展示基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis）结果，说明某一基因集合（如通路、功能类别）在排序后的基因列表中是否富集于顶端或底端。常用于转录组、蛋白质组差异表达下游分析。

## 读图维度

### 1. 排序指标与排序逻辑

- **基因排序依据**：
  - Signal2Noise ratio？logFC？t-statistic？Correlation？
  - 排序方向：高表达→低表达？病例→对照？
- **排序方向含义**：
  - 左侧（顶端）= 在 Case 中高表达 / 正相关
  - 右侧（底端）= 在 Control 中高表达 / 负相关

### 2. 富集曲线 (Enrichment Plot)

- **曲线形态**：
  - 高峰靠左 = 基因集富集于排序列表顶端（Case-associated）
  - 高峰靠右 = 富集于底端（Control-associated）
  - 平坦 = 无显著富集
- **峰值位置**：
  - 峰值在哪个分位数？（ES 最大点）
  - 峰值是否陡峭？（富集程度强 vs 弱）

### 3. 核心统计量

- **ES (Enrichment Score)**：
  - 标准化 ES (NES) 范围通常在 -3 到 +3
  - |NES| > 1 通常被认为有意义（软件默认阈值）
  - 但作者使用的实际阈值是什么？
- **p-value / FDR (q-value)**：
  - q < 0.05 还是 q < 0.25？（GSEA 默认用较宽松的 0.25）
  - 是否经过多重检验校正？
- **Leading Edge**：
  - 哪些基因贡献了主要富集信号？
  - Leading edge 基因数 / 基因集总基因数 = ?

### 4. 基因位置分布

- **中间条的竖线**：
  - 每个竖线代表该基因集中的基因在排序列表中的位置
  - 竖线是否集中在左侧/右侧？还是均匀分布？
- **基因集大小**：
  - 总基因数是否在合理范围（15-500）？
  - 过小（<15）或过大（>500）的基因集结果不可靠

### 5. 热图条带

- **热图含义**：
  - 通常表示所有基因的表达谱（红=高表达，蓝=低表达）
  - 或表示基因与表型的相关性
- **观察要点**：
  - 热图颜色在 Leading Edge 区域是否一致？
  - 是否呈现清晰的分层？

## 常见陷阱

| 陷阱 | 识别方法 | 风险 |
|------|---------|------|
| **宽松FDR阈值** | q<0.25 作为显著性 | 大量假阳性通路，需要 q<0.05 |
| **基因集大小不当** | 看基因集总基因数 | 过小缺乏统计力，过大失去特异性 |
| **排序指标选择偏差** | 检查 ranking metric | 不同指标可能产生不同结果 |
| **Permutation次数不足** | nPerm < 1000 | p值不稳定，结果不可重复 |
| **多重数据库扫描** | 同时测试数百个基因集 | 即使 q-value 校正，仍可能过拟合 |

## 关键问题模板

1. "GSEA 使用 q<0.25 作为阈值，如果收紧到 q<0.05，该通路是否仍然显著？"
2. "富集曲线峰值靠左，但 Leading Edge 基因只占基因集的 20%，富集信号是否主要由少数基因驱动？"
3. "排序使用的是 Signal2Noise，如果改用 logFC 或 t-statistic，该通路是否仍然富集？"
4. "该基因集包含 400+ 基因，是否过大导致失去生物学特异性？"

## 一句话总结

> GSEA 图的核心是**"看排序、看曲线、看Leading Edge、防宽松阈值"**——富集曲线的峰值位置和陡峭度比单纯的 p 值更能说明问题。
