# 热图与聚类图阅读指南

## 适用场景
- 展示矩阵数据（基因表达、蛋白质丰度、相关性等）
- 识别样本或特征的相似性模式
- 展示通路/基因集的活性

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## 核心阅读维度

### 1. 聚类结构（如果存在）
- **行/列聚类**：样本或基因是否形成明显分组？
- **聚类算法**：通常用层次聚类（hierarchical），距离度量（Euclidean/Pearson/correlation）和链接方法（complete/average/Ward）会影响结果
- **稳定性**：如果改变距离度量，聚类模式是否仍然稳定？（不稳定的聚类不可靠）

### 2. 颜色与标准化
- **颜色梯度**：
  - 红-蓝：通常表示上调-下调（表达量）
  - 黄-黑-蓝：通常表示激活-中性-抑制（通路活性）
  - **必须确认**：caption是否明确说明颜色含义？
- **标准化方法**：
  - **Z-score**：(x - mean) / SD，突出相对变化，适合跨样本比较
  - **Log转换**：用于偏态分布（如RNA-seq count数据）
  - **Percentile**：将数据映射到0-100%，丢失绝对量信息
  - **Min-Max**：映射到[0,1]，对异常值敏感
  - **关键问题**：标准化方法是否适合数据类型？（如RNA-seq应该用log2 TPM/FPKM，而不是原始count）

### 3. 注释条（Annotation Bars）
- **顶部/侧边色条**：是否标注了临床特征（如亚型、分期、治疗响应）？
- **一致性**：热图聚类模式与注释特征是否一致？（如：热图分3组，注释条也正好分3组 = 好）
- **遗漏信息**：是否有重要协变量未标注？（如批次效应、性别、年龄）

### 4. 关键区域
- **高亮块**：作者是否在文中特别指出了某些区域？
- **边界清晰度**：分组之间的边界是清晰还是模糊？（模糊 = 亚型定义不稳健）
- **一致性**：同一组内的样本是否表现一致？（组内方差大 = 亚型异质性高）

### 5. 行列选择
- **样本选择**：是否排除了某些样本？原因是什么？（如QC失败）
- **特征选择**：
  - 是全部基因还是筛选后的子集？
  - 筛选标准是什么？（方差top N？差异表达？已知标记？）
  - **风险**：先筛选再聚类会造成"循环论证"（看起来有结构，其实是因为你选了有结构的基因）

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## 常见陷阱

| 陷阱 | 说明 | 如何识别 |
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| 循环论证 | 用差异基因做聚类，然后说"我们发现两个亚型" | 看方法部分：聚类用的基因是否预先筛选过？ |
| 批次效应伪装 | 聚类按批次而非生物学分组 | 问：如果有批次注释条，是否与聚类一致？ |
| 颜色误导 | 非对称颜色映射或断裂色阶 | 看color bar是否连续、是否以0为中心 |
| 过度解读 | 把噪声当成模式 | 问：如果随机打乱数据，聚类是否还明显？ |

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## 批判性提问模板

1. "聚类用的基因是如何筛选的？是否预先基于差异表达筛选？"
2. "颜色标准化方法是什么？Z-score、log、还是percentile？"
3. "如果有批次效应，热图是否能区分批次和真实生物学差异？"
4. "聚类结果的稳定性如何？换用不同距离度量或聚类算法，模式是否一致？"
5. "作者声称的亚型数量（如k=3）是否有统计支持？（如gap statistic, silhouette score）"
